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免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)

免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)

简要描述:
免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。
当细胞在非变性条件下被裂解时,完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相免疫共沉淀互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X,那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体

更新时间:2021-03-26

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厂商性质:其他

  • 样品准备

将不同分组的细胞从培养箱中取出(每组210cm的皿),在冰上用预冷的PBS洗一遍,加入裂解液(20mM Tris-HCL Ph7.5150 mM Nacl1%TritonX-1001 mM EDTA和蛋白酶抑制剂),用细胞刮裂解细胞。13000rpm 4℃离心10min,去上清进行蛋白定量。定量后原液备用。

  • 蛋白定量

1 标准曲线的绘制:取一块酶标板,按照下表加入试剂

孔号

1

2

3

4

5

6

7

8

蛋白标准液(μl

0

2

4

6

8

12

16

20

去离子水(μl

20

18

16

14

12

8

4

0

蛋白浓度(μg/μl

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.3

0.4

0.5

 

2. 根据样品数量,将BCA试剂A与试剂B按体积比为50:1配制适量BCA工作液,充分混匀;

3. 各孔加入160μl BCA工作液;

4. 把酶标板放在振荡器上振荡30sec37℃放置30分钟,然后在562nm下测定吸光度。以吸光值为横坐标,蛋白浓度(μg/μl)为纵坐标,绘出标准曲线;

5. 在酶标板中加入2μl待测蛋白和18μl PBS(稀释10倍),加入160μl BCA工作液把酶标板放在振荡器上振荡30sec37℃放置30分钟,然后在562nm下测定吸光度

6. 根据所测样品的吸光值,在标准曲线上即可查得相应的蛋白浓度(μg/μl,乘以样品稀释倍数(10)即为样品实际浓度(单位:μg /μl)。

  • 共沉淀
  • 根据蛋白定量结果,将各组蛋白留取适量用于做input对照;
  • 分别取各组细胞蛋白置于21.5ml离心管中(2mg每管),其中一个加入2ug IgG,另外一个加入2ug IP指标对应的抗体,冰上孵育2h
  • 分别向两个管子中加入protein G-Agarose beadsRoche),加裂解液至1ml4℃旋转混匀,孵育过夜;
  • 2500rpm4℃离心1min,去上清,1ml裂解液洗涤沉淀4次;
  • 加入2×蛋白上样缓冲液,轻轻混匀后煮沸5min2500rpm离心1min,弃沉淀;
  • 将上清转移至新的离心管中,用于western blot检测相应蛋白。
  • PAGE胶的制备

1. 下层分离胶的制备

根据目的蛋白的分子量选择不同的凝胶浓度,高分子量蛋白用低浓度胶,低分子量蛋白用高浓度胶分离。 GRα 90kDa  AP-1  43.48kDa   IkB  39kDa  STAT3 7986kDa  NF-KB p65   故选用10%的胶。不同浓度的分离胶按下表进行配制,待下层胶凝固后进行上次浓缩胶的配制。 

2. 上层浓缩胶的配制

根据需要按下表配制浓缩胶,并插好梳子。 

  • 上样及电泳

1. 上样

每孔上样量约为20ul蛋白,可以根据实验要求加大上样量。将配制好的PAGE胶放入电泳槽中,加入适量电泳缓冲液,取下梳子用枪轻轻吹打加样孔,避免孔内有余胶残留影响上样。将准备好的样品用加样枪慢慢加到对应的孔内,注意勿溢出加样孔。

2. 电泳

一般浓缩胶80V 20分钟,分离胶120V 60分钟,可以根据具体实验要求调整电压和时间。当染料到达胶底部时切断电源,停止电泳,进行下一步转膜。

  • 转膜

转膜分为湿转和半干转,本实验室选用半干转。

半干式转膜中,三明治的排列为:////纸,用电转缓冲液浸湿后,直接置于电转仪的正负极之间。胶于负极而膜置于正极。半干式的电转缓冲液不同于湿式的电转缓冲液,推荐为:48 mM Tris, 39 mM glycine, 0.04% SDS, 20%甲醇。25V转膜30分钟即可。转膜前将PVDF膜在甲醇中浸泡1-2 分钟(NC膜在电转液中浸泡10-20分钟),再孵育于冰冷的电转缓冲液中5 分钟,胶也需在冰冷的电转缓冲液中平衡3-5 分钟,否则转膜时会导致条带变形。

  • 膜上蛋白的检测

为检测转膜是否成功,可用丽春红染色,丽春红染色工作液:2%的丽春红贮备液110 稀释,即加9 倍的ddH2O

染色方法:将膜放入TBST 洗一次,再置于丽春红染色工作液中,在室温下摇动染色5 分钟,大量的水洗膜直至水变清无色蛋白条带清晰,(膜也可以用TBST 或水重新洗后再进行染色)PVDF 膜需用甲醇再活化后用TBST洗后进行封闭。

  • 膜的封闭及抗体孵育

1. 封闭:5%脱脂奶粉(检测磷酸化蛋白用BSA)室温封闭1小时或4过夜。

2. 一抗:根据说明书GRα 1:800  AP-1  1:1000    IkB  1:1000  STAT3 1:1000  NF-KB  11000  稀释抗体,抗体加入封闭液中稀释到所需浓度,和膜室温孵育2小时或4 ℃孵育过夜。

3. 二抗:孵育一抗的膜用TBST洗涤3次,每次5min。随后根据用量,按照1:1000稀释HRP标记的二抗,与膜37℃孵育1h。用TBST洗涤3次,每次5min

  • 显色

ECL化学发光检测:配制ECL发光液,根据用量,取ECL发光液AB等量混匀,加在膜的正面暗室避光5分钟。倒掉显色液,用纸小心吸取显色液,在上面盖上一层平整的透明纸。将其放入成像系统中进行扫描。可以根据条带强弱再次感光或减短感光时间已达到理想结果。

 

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